首个非瘟病毒基因Ⅱ型毒株口服疫苗研发突破 有望用于家猪!

　　对免疫接种的II组和III组共12头野猪进行检测，在它们和攻毒后携带ASFv的野猪直接接触的24天后，其中有11头野猪对ASFv表现出良好的免疫效果，没有发病反应，经过免疫接种的II组和III组的12头野猪的存活率为92%。

　　西班牙国家暨世界动物卫生组织(OIE)非洲猪瘟病毒研究实验室主任、西班牙马德里康普顿斯大学兽医卫生监测中心教授

　　自上世纪60年代算起，针对非洲猪瘟病毒(ASFv)疫苗研发已接近60年，但由于对ASFv感染保护性免疫诸多方面的研究和认知尚不够清楚，针对传统灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒活载体疫苗、减毒活疫苗、基因突变疫苗(包括基因缺失疫苗)的研发方面亦未取得比较大的进展。

　　目前，全球至少8个国家15个研究机构正致力于ASFV疫苗研发。2019年1月，中国启动非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗研发项目。2018年10月，硕腾公司(Zoetis)被授予独家使用由美国康涅狄格大学研究发布的“基于MGF基因缺失的减毒非洲猪瘟疫苗”的专利。2018年3月，西班牙的科学家发表防控ASFv感染的缺失某些特定基因的弱毒活疫苗的研究成果。2017年底，欧盟发起了针对ASFv疫苗的创新行动。

　　由于ASFv基因突变疫苗(包括基因缺失疫苗)可以提供完全保护作用，是目前最具开发潜力的疫苗。虽然非洲猪瘟病毒对家猪造成的威胁更严重，但野猪ASFv疫苗的开发对全球ASF控制与根除有着重要意义，特别是非洲地区和欧盟地区，其次是中国，因为中国不少地区野猪分布比较密集，且将来野猪感染ASFv的情况在中国会更加严重，而森林ASFv传播管理也不可忽视。在今年3月于北京举行的2019年国际猪业科学论坛上，世界知名非洲猪瘟专家、对非洲猪瘟有着40年研究经验的西班牙国家暨世界动物卫生组织(OIE)非洲猪瘟病毒研究实验室主任、西班牙马德里康普顿斯大学兽医卫生监测中心教授何塞·马纽埃尔比·桑切斯·斯凯诺(José Manuel Sanchez-Vizcaino)在《首个针对ASF病毒基因Ⅱ型毒株的野猪口服疫苗的研发与试验情况》主题报告表示，目前经过免疫攻毒试验表明，这种ASFv基因突变疫苗对野猪具有较好的免疫效果，且具有较好的安全性，下一步将进行野猪实际免疫接种研究以及家猪免疫接种实验研究。

　　“非洲猪瘟病毒既有森林的传播，也有家畜之间的传播。我们要研究为什么非洲软蜱、非洲野猪/非洲疣猪ASFv耐受，虽然它们长期携带ASFv，但它们不发病。我们希望能有疫苗对这些ASFv宿主和传播ASFv的动物进行免疫接种，从而根除ASF病毒。”桑切斯·斯凯诺说，“我在研究非洲猪瘟第一年的时候，就考虑过如何开发此类疫苗的问题。当时，我们实验室开发了一种ASFv疫苗，但给一些野猪接种这种疫苗后，发现其中大多数野猪反而因此致死。鉴于此，我们这40多年来投入大量时间和精力进一步开发ASFv疫苗。幸运的是，我们在ASFv疫苗方面的研发目前已取得初步成效。”

　　“很多时候，ASFv灭活疫苗的保护作用非常不明显，实际效果也很有限。”桑切斯·斯凯诺分析说，对于所有的ASFv基因型来说，虽然ASFv减毒活疫苗往往会带来更多的保护，但由于它存在残余毒力、病毒血症、亚临床症状等安全性问题，具有致病风险，安全性不高。因此，“我们转向ASFv基因突变疫苗的研发。通过多年研究开发，现已获得突破性进展，感觉像得到一份圣诞节大礼物一样。”

　　“2017年，拉脱维亚发生非洲猪瘟疫情，这次疫情感染率非常高，主要是感染ASFv基因II型毒株。当时，我们在拉脱维亚发现了一头感染ASFv基因II型毒株的野猪，经取样后，在我们实验室进行检测、研究。”桑切斯·斯凯诺说，“我们对此发病野猪样品中的ASFv基因进行排序之后，发现其中有基因发生突变，我们对它的突变基因进行研究后，开发了世界首个ASF病毒基因II型毒株野猪口服疫苗(Lv17/WB/RIE1，通过对拉脱维亚2017年感染ASFv的发病野猪的突变基因研究而开发的疫苗)。在此，向大家介绍针对此疫苗的两个实验：一个是这种ASFv基因II型口服疫苗的野猪免疫接种及免疫强毒攻毒实验;另外一个是针对这种ASFv基因II型毒株口服疫苗免疫野猪进行的强毒攻毒交叉感染及其保护效果的实验;这两个实验中，攻毒均采用ASF病毒Armenia 07基因II型强毒株(亚美尼亚2007年发生非洲猪瘟疫情，主要为ASFv基因II型，感染率也非常高)。”

　　他还介绍说，这两个实验持续了近两个月的时间，采用了TCID50 测定(组织半数感染量，即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡所需的病毒量)、 红细胞吸附试验(HAD)、实时荧光PCR(聚合酶链式反应)、免疫过氧物酶试验(IPT)、ELISA(酶联免疫吸附试验)等方法，每周对实验组和对照组野猪的全血、血清、唾液、排泄物、直肠温度检测两次，结合病毒血症、抗原、临床症状、剖检结果做了综合分析和研究。

　　“在这两个实验中，我们一共选了18头月龄为3～4个月的小野猪。实验前，它们单个体重为10～15千克;实验结束后，它们单个体重增加到20～25千克。”桑切斯·斯凯诺说，“在西班牙，人们会猎扑一些野猪进行养殖。我们购买的这些进行实验的小野猪，均来自于当地的一家养猪场。”

　　“第一个实验主要是检验实验组(接种这种ASFv基因II型毒株口服疫苗后的野猪)的免疫应答、临床症状、攻毒感染及死亡情况。”桑切斯·斯凯诺说，第一个实验中，对照组共有6头野猪，实验组共有12头野猪：

　　√I组(BOX1)：对照组,有6头未感染ASFv的野猪;

　　√II组(BOX2)：实验组，有5头野猪，其中4头通过口服免疫接种，1头通过接触进入体内的方式免疫接种;

　　√III组(BOX3)：实验组，有7头野猪，其中5头通过口服免疫接种，2头通过接触进入体内的方式免疫接种。

　　√与对照组比较，唯一有区别的临床症状是体温变化——实验组中的12头野猪中，有8头野猪平均体温为40.1～40.8 °C，有轻微的升高;

　　√经实时荧光PCR检测结果显示，病毒血症方面，偶发(零星出现)弱阳性表达——12头野猪中，有8头Ct值等于33.02±4.07(Ct values，Cycle threshold values，即循环阈值，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)。

　　通过ELISA抗体(AB)检测的数据显示：

　　√在免疫接种后的第1周(第1天到第7天)，抗体检测没有明显变化;

　　√在免疫接种一周后(第7天到第30天)，抗体检测呈现阳性的野猪数量开始增加，抗体阳性率开始上升;

　　√到免疫接种第30天(攻毒前一天)，实验组12头野猪中，抗体检测呈现阳性的野猪数量达到8头：9头口服免疫接种的野猪中，有6头抗体检测呈现阳性;3头采用接触进入体内的方式免疫接种的野猪中，有2头抗体检测呈现阳性;实验组抗体阳性率达到66.6%;

　　√在免疫接种后的第31天，用ASF病毒Armenia 07基因II型强毒株对实验组的野猪进行攻毒，在攻毒后的前5天(免疫接种后的第31天到第35天)，实验组的野猪抗体阳性率较攻毒前一天开始升高，虽然升高幅度较小，但已超过70%这一临界值;在攻毒后的第6天到第10天(免疫接种后的第35天到第41天)实验组的野猪抗体阳性率明显升高，在攻毒后的第8天升高幅度出现略微减小趋势;在攻毒后的第9天(免疫接种后的第40天)，实验组的野猪抗体阳性率达到90%左右。

　　“从以上抗体检测结果来看，实验组免疫接种及免疫攻毒的整体抗体阳性率均保持较高水平，这说明我们开发的这种ASFv基因II型毒株口服疫苗对野猪具有较好的免疫效果(ELISA检测的抗体阳性率越高，说明猪群对ASFv免疫效果/攻毒保护效果越好)。” 桑切斯·斯凯诺如此分析说。

　　桑切斯·斯凯诺介绍说，第二个实验中，对未感染ASF病毒的6头野猪中的4头野猪，进行ASF病毒 Armenia 07基因II型强毒株攻毒，2头作为攻毒试验对照的野猪，然后将它们分成2组，分别与免疫接种这种ASFv基因II型毒株口服疫苗30天的II组、III组的野猪混养(见上图)。然后，通过取样检测，来监测攻毒后已感染ASFv的野猪会否将它们携带的ASFv传染给同组混养的其他野猪，并监测同组野猪之间会否发生ASFv交叉传染的情况。

　　√I组(BOX1)：6头未感染ASFv的野猪被分成2批：第1批3头野猪，作为攻毒试验对照(未感染ASFv)的野猪1头，通过肌肉注射(IM)方式进行攻毒(通过肌肉注射方式，感染ASF病毒Armenia 07基因II型强毒株，下同)的野猪2头，然后与II组的野猪混养在一起;第2批3头野猪：作为攻毒试验对照(未感染ASFv)的野猪1头，通过肌肉注射方式进行攻毒的野猪2头，然后与III组的野猪混养在一起;

　　√II组(BOX2)：在免疫接种的第1天到第30天，有5头野猪，其中4头通过口服免疫接种，1头通过接触进入体内的方式免疫接种;自攻毒第1天(免疫接种第31天)起，II组混养有8头野猪。

　　√III组(BOX3)：在免疫接种第1天到第30天，有7头野猪，其中5头通过口服已经免疫接种，2头通过接触进入体内的方式已经免疫接种;在这2头采用接触进入体内的方式已经免疫接种的野猪中，对其中1头采用肌肉注射方式进行攻毒;自攻毒第1天(免疫接种第31天)起，III组混养有10头野猪。

　　桑切斯·斯凯诺分析称，通过54天的免疫接种与24天的免疫攻毒混养监测结果显示：

　　√对免疫接种的II组和III组的12头野猪(包括1头采用肌肉注射方式攻毒的已免疫接种的野猪)进行检测，采用口服免疫接种的1头野猪在和攻毒后携带ASFv的野猪直接接触后的第5天，因感染ASFv而死亡，II组和III组12头野猪的死亡率为8%;

　　√对免疫接种的II组和III组共12头野猪进行检测，在它们和攻毒后携带ASFv的野猪直接接触的24天后，其中有11头野猪对ASFv表现出良好的免疫效果，没有发病反应，II组和III组的12头野猪的存活率为92%。

　　“通过以上两个实验研究分析，我们找到了3个问题的答案。”桑切斯·斯凯诺总结说：

　　√第一，疫苗的免疫效果和安全性问题。我们开发的这种ASFv基因II型毒株口服疫苗对野猪能够产生良好的免疫应答，没有造成野猪不良反应，也没有出现野猪死亡的现象，说明这种ASFv疫苗对野猪的免疫效果和安全性均较高。

　　第二，免疫接种后，会否通过直接接触的方式感染ASFv?感染率高还是低?这个答案是肯定的，但感染率较低(8%)。因为监测显示，免疫接种后的12头野猪与感染ASFv的野猪混养在一起进行直接接触后，经过3～4天的时间，免疫接种的野猪中就会发生感染ASFv的现象，但仅有1头口服免疫接种的野猪被感染，然后在混养直接接触后的第5天因此致死。

　　第三，这种ASFv疫苗能不能对交叉感染起到良好的保护作用?通过监测来看，我们开发的这种ASFv疫苗对ASF病毒Armenia 07基因II型强毒株的交叉感染具有良好的保护效果，经过免疫接种的II组和III组的12头野猪当中，经检测有11头没有发病发应，存活率为92%。

　　“针对我们实验室开发的这种野猪ASF病毒基因II型毒株口服疫苗，我们对接种这种免疫疫苗后的未发病野猪和攻毒感染ASF病毒Armenia 07基因II型强毒株(Armenia/07)后的发病野猪进行了剖检，并对它们各自的脏器组织和淋巴器官进行病理比较研究发现，前者和后者的多个脏器组织及多处淋巴器官有着明显差异(见上图)。”桑切斯·斯凯诺如此分析说。

　　“我们研究分析了18组脏器组织和淋巴器官等部位的变化情况，包括脾脏、肾脏、肝脏、肺脏、心脏、脑部、骨髓、膀胱、肠道、扁桃体以及下颌淋巴结、腹股沟淋巴结、咽后淋巴结、肠系膜淋巴结、胃部与肝脏之间的淋巴结、肩胛骨前的淋巴结、肾部淋巴结、纵隔淋巴结。” 桑切斯·斯凯诺表示，与免疫接种后的未发病野猪比较，感染ASFv后的发病野猪的脾脏发生肿大的症状尤为明显，还有林巴系统病变、肺部感染发炎、肠道系统病变也比较明显。

　　“为了进一步检验这种ASF病毒基因II型毒株口服疫苗的免疫效果，我们还通过实时荧光PCR对对照组和实验组的共18头野猪的16个组织进行剖检，如图从左到右依次排列为4组，每组4个组织，包括：骨髓、脑部、胃部与肝脏之间的淋巴结、心脏;腹股沟淋巴结、肾脏、肝脏、肺脏;纵隔淋巴结、肠系膜淋巴结、肩胛骨前的淋巴结、肾部淋巴结;咽后淋巴结、脾脏、下颌淋巴结、腹股沟淋巴结、咽后淋巴结、肠系膜淋巴结、胃部与肝脏之间的淋巴结、肩胛骨前的淋巴结、肾部淋巴结、膀胱系统;并将检测所得Ct值(Ct values，Cycle threshold values，即循环阈值，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)与剖检最后一次检测到病毒血症的天数进行比较，以此来确定ASFv的水平。” 桑切斯·斯凯诺说，“图中的蓝色表示已免疫接种，灰色表示已免疫接种但没有保护作用，黄色表示后期有接触，红色表示进行采用肌肉注射方式进行攻毒。从这16个组织各自的Ct值来看，目前的免疫效果良好，且我们开发的这种野猪口服疫苗免疫接种所用的剂量不是特别高，实验结果比较满意。”

　　“目前，这种ASFv疫苗对野猪进行免疫接种的效果比较稳定，我们对这种疫苗的研发还在持续进行中，我们将通过研究比较每头野猪服用更多剂量与服用更少剂量有什么区别，是不是前者的免疫效果比后者更好、保护性更安全。”桑切斯·斯凯诺说，“下一步，我们希望针对这种疫苗能够进行体内和体外的免疫接种研究，并确定针对野猪群中的每头野猪在实际使用过程中免疫接种的最佳剂量，以及进行免疫接种的最佳时间和最佳间隔周期。”

　　“截至目前，我们对这种ASF病毒基因II型毒株野猪口服疫苗免疫接种和免疫攻毒的实验研究进行了50天，我们认为这一时间还不够长。”桑切斯·斯凯诺表示，“未来，我们将投入更长时间对这种疫苗进行野猪免疫接种的实验研究和野猪群免疫接种的实际应用研究，分析实验室和实际应用中的免疫效果分别能够持续多长时间;同时，我们还希望对家猪做进一步的免疫接种和免疫攻毒实验，以此研究家猪对这种疫苗的免疫反应、免疫效果，以及这种疫苗在家猪免疫接种过程中的安全性和保护性。”